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Verfahrenstechnik 5/2016

Verfahrenstechnik 5/2016

Ulrike Becken,

Ulrike Becken, Christiane Schlottbom Biopolymere wie Polyhydroxybutyrat (PHB) gelten als CO 2 -neutrale, biologisch abbaubare und damit umweltfreundliche Alternative zu herkömmlichem Plastik. Sie sind jedoch immer noch vergleichsweise teuer. Der Einsatz alternativer Rohstoffe kann dazu beitragen, die Herstellungskosten deutlich zu senken und so die Akzeptanz am Markt zu erhöhen. Auf dem Weg zur Kommerzialisierung Optimierung und Scale-up einer Biopolymer-Produktion Verschiedene Bakterienstämme synthetisieren Polyhydroxyalkanoate wie PHB aus Zuckern. Die mechanischen, physikalischen und thermischen Eigenschaften dieser Biopolymere ähneln denen vieler Kunststoffe, die aus fossilen Rohstoffen hergestellt werden, wie Polypropylen (PP) und Polyethylen (PE), und können diese potenziell in vielen Bereichen ersetzen. Durchschnittlich 50 % der Kosten für die Biopolymerproduktion, machen die verwendeten Rohstoffe aus [1]. Der Einsatz günstiger Ausgangsmaterialien, wie ligninhaltiger Kohlenstoffe, birgt ein entsprechend hohes Einsparpotenzial. Prozessingenieure der portugiesischen Firma Biotrend haben einen robusten Fermentationsprozess zur Produktion von PHB aus Weizenstrohhydrolysat durch Bacillus sacchari entwickelt. Dazu haben die Ingenieure zunächst verschiedene Kohlenstoffquellen getestet, um den Einfluss der Zusammensetzung des Hydrolysats auf das bakterielle Wachstum und die PHB-Produktion zu untersuchen. Unter Ver wendung von Eppendorf-Fermentationssystemen wurde der Prozess dann ausgehend von einem Arbeitsvolumen von 2 l schrittweise 100-fach hochskaliert. Als Basis für die Maßstabsvergrößerung wurde eine konstante Spitzengeschwindigkeit des Rührers gewählt. Autoren: Ulrike Becken, Christiane Schlottbom, beide Eppendorf AG Bioprocess Center, Jülich Einfluss des Hydrolysats Im ersten Schritt wurde der Effekt der Hy drolysatzusammensetzung auf PHB-und Biomasseproduktion untersucht. Die Zusammensetzung von Weizenstrohhydrolysat wurde dazu durch Medien simuliert, die Xylose und Glukose in verschiedenen Mengenverhältnissen enthielten. Diese Versuche wurden in einem Eppendorf-Fermenter mit einem 2 l-Gefäß (Arbeitsvolumen 0,8 – 2,2 l) durchgeführt. Das Kulturmedium enthielt initial Saccharose. Sobald diese verbraucht war, wurden in der Fed-Batch-Phase verschiedene Medien zur Fütterung getestet. Induziert wurde die Fütterung abhängig von der Rührgeschwindigkeit: Ein Versiegen der Kohlenstoffquelle führt zu einer reduzierten Sauerstoffaufnahme durch die Kultur, wodurch der Gelöstsauer stoff im Medium ansteigt. Zur Ein haltung des Sollwerts wurde die Rührgeschwindigkeit vom System gedrosselt. Dies diente als automatischer Trigger zum Start der Fütterung. In allen 2-l-Fermentationen entwickelten sich Biomasse, PHB-Produktion und Fütterungsraten ähnlich. Mit ansteigender Xylose konzentration im Fütterungsmedium stieg auch die Xylosekonzentration im Fermenta tionsmedium an, ein Anstieg bis auf 35 g/l führte jedoch nicht zu einer Inhibition des Wachstums [2]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entwickelte Fermentationsstrategie auch bei variablen Mengenverhältnissen von Xylose und Glukose im Hydrolysat funktionieren wird. Optimierung und Scale-up Nach Optimierung der Prozessbedingungen im 2-l-Maßstab wurde der Prozess schrittweise hochskaliert. Dazu wurde die Rührgeschwindigkeit jeweils reduziert, sodass die Rührerspitzengeschwindigkeit in jedem Maßstab gleich war. Zunächst wurden Fermentationen in 10-l- Gefäßen (Arbeitsvolumen von 4-l – 10,5-l) durchgeführt, kontrolliert durch einen in situsterilisierbaren Fermenter. Zur Fütterung wurden Lignocellulose-Hydrolysate aus Weizenstroh (Biorefinery.de GmbH, Teltow) Arbeitsvolumen Fütterung BTM [g/l] PHB [g/l] PHB [%] YX/S [g/g] YP/S [g/g] 2 l Hydrolysat 123,4 63,6 51,6 0,42 0,23 10 l Hydrolysat 123 64,6 52,5 0,4 0,19 50 l Zucker-Mix 101,6 56,3 55,4 0,42 0,25 200 l Zucker-Mix 129 71,1 56,2 0,45 0,22 Biomasse- und PHB-Produktion in 2-l-, 10-l-, 50-l- und 200-l-Fermentationen (BTM = Biotrockenmasse, Y X/S = spezifische Ausbeute der Biomasseproduktion, Y P/S = spezifische Ausbeute der PHB-Produktion) 14 VERFAHRENSTECHNIK 5/2016

VERFAHREN UND ANLAGEN 01 Vergleich der Produktivität in 2-l-, 10-l-, 50-l- und 240-l-Fermentern 02 Rührerspitzengeschwindigkeiten (A) und Umdrehungsgeschwindigkeiten (B) in drei Fermentationen im 2-l-, 10-l- und 50-l-Maßstab: Der Gelöstsauerstoff wurde durch Anpassen der Agitation bei einem Sollwert von 10 % geregelt oder eine Glukose/Xylose-Mischung verwendet. Im Vergleich zu kleinen Kulturen sind die Rührgeschwindigkeiten in größeren Volumina niedriger und variieren weniger. Deshalb war abzusehen, dass eine In duk - tion der Fütterung ausgelöst durch einen Abfall der Rührgeschwindigkeit weniger robust funktioniert würde. In Fermentationsprozessen ab 10-l wurde die Fütterung darum direkt durch Anstieg des Gelöstsauerstoffs induziert. Im nächsten Schritt wurde diese Fütterungsstrategie für Fermentationen in einem 50-l-Gefäß (Arbeitsvolumen von 16 – 50-l) angewendet. Im 50-l-Maßstab akkumulierten äquivalente Mengen an Biomasse und PHB wie in den kleineren Volumen. Gegen Ende der Fermentation stieg der Sauerstoffgehalt als Reaktion auf Glukosemangel weniger stark an, was zu einer suboptimalen Fütterung führte. Dies resultierte in der Akkumulation von Xylose und dem Abfall der Ausbeuten von Biomasse und PHB. Wenn mehrere Stunden zwischen dem Verbrauch der Glukose und dem Beginn der Fütterung lagen, in denen die Kultur ausschließlich auf Xylose wuchs, wurde die metabolische Aktivität nie vollständig wiederhergestellt. Entsprechend sollte der Zeitraum bis zum Start der Fütterung minimiert werden. 200-l-Fermentation Durch Integration aller Informationen aus den vorangegangenen Experimenten entwickelten die Prozessingenieure dann ein Fermentationsprotokoll im 200-l-Maßstab (Arbeitsvolumen 75,5 – 240-l). Auch hier waren die Konzentrationen von Biomasse und PHB vergleichbar zu denen im kleineren Maßstab. Die Produktivität in den verschiedenen Fermentationsvolumen war im 2-l-Maßstab am größten, jedoch erlaubt das im Vergleich zum initialen Volumen (0,8 l) kleine Fütterungsvolumen (0,8 l) keine Fütterung über einen langen Zeitraum und die Produktivität fiel nach Erreichen des Maximums wieder ab. Die Produktivität in den 200- und 2-l-Fermentationen entwickelte sich sehr ähnlich, während im 10- und 50-l-Maßstab PHB, bedingt durch die oben beschriebene verzögerte Fütterung, zeitverzögert produziert wurde. Der kurze Einbruch in der Produktivitäts kurve der 200-l-Fermentation bei etwa 1 g/(l·h) deutet darauf hin, dass die Fütterung optimiert werden kann. Das Plateau bei einer Produktivität von etwa 1,7 g/(l·h) deutet aber auf einen robusten Prozess mit konstanter maximaler Produktivität hin. Das Aufrechterhalten einer hohen Produktivität ist ein primäres Ziel in der Optimierung eines Bioprozesses. Die sorgfältige Optimierung des Protokolls in einem kleinen Volumen resultierte in robusten und skalierbaren Prozessen und ermöglichte einen bereits im ersten Versuch erfolgreichen Produktionsprozess im 200-l- Maßstab. Dies lässt schließen, dass das gleiche Protokoll auch in größeren Volumen in kommerzieller Produktion funktionieren wird. „Die BioFlo-Fermenter von Eppendorf ermöglichen einmalige Flexibilität und Leistungsfähigkeit für Prozessentwicklung und Scale-up. Sie sind Kernstück der Bioprozessentwicklung bei Biotrend und tragen wesentlich dazu bei, das Vertrauen unserer Kunden zu stärken“, fasst Firmenchef Bruno Sommer Ferreira die Erfahrungen seines Teams zusammen. www.eppendorf.com/bioprocess Dieses Projekt wurde von der Firma Biotrend (Cantanhede, Portugal) unter der Leitung von Bruno Sommer Ferreira durchgeführt Literaturhinweise: [1] E4tech, RE-CORD and WUR (2015): „From the Sugar Platform to biofuels and biochemicals“, Final report for the European Commission, contract No. ENER/C2/423-2012/SI2.673791 [2] Sommer Ferreira, Bruno; Schlottbom, Christiane: „Production of Polyhydroxybutyrate from Lignocellulosic Hydrolysates – Optimization of Bacillus sacchari Fermentation and Scale Up from 2 l to 200 l“, Eppendorf Application Note, 2016 Quality Heat Exchangers SO FLEXIBEL WIE IHRE ANSPRÜCHE. Qualität beginnt im Detail. Wir leben Qualität. Wir sind FUNKE. FUNKE Wärmeaustauscher Apparatebau GmbH . Zur Dessel 1 . 31028 Gronau / Leine . Germany . T +49 (0) 51 82 / 582 - 0

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